Гистологическое исследование кожи после ее обработки пикосекундным александритовым лазером с дифракционным оптическим массивом

Эмиль А. Тангетти, доктор медицины. Центр дерматологии и лазерной хирургии, улица 5601 J, Сакраменто, Калифорния 95819

Источник: The Histology of Skin Treated With a Picosecond Alexandrite Laser and a Fractional Lens Array

Предпосылки и цели

Не так давно мы получили одобрение FDA на использование пикосекундного александритового лазера для удаления рубцов постакне и морщин.  В 2014 году мы уже представляли медицинской общественности данные гистологии кожи после воздействия пикосекундного александритового лазера in vivo и ex vivo. Настоящая работа является расширением пилотного исследования 2014 г. В ней мы сделали упор на изучение гистологии кожи с применением конфокального микроскопа, описание наблюдаемых изменений кожных покровов после воздействия лазерного излучения различной интенсивности (при изменении настроек аппарата).

Материалы и методы

Мы использовали пикосекундный александритовый лазер с длиной волны 755 нм с фракционной оптикой с тремя различными параметрами энергии для лечения in vivo. После проведенного лечения проводилась оценка состояния кожи с помощью конфокального микроскопа, выполнялась биопсия с последующим гистологическим исследованием биоптатов .

Результаты

Гистологическое исследование выявило уникальные внутриэпидермальные полости. Количество, плотность и размер этих полостей, оцениваемые с помощью конфокального микроскопа,  зависели от индекса меланина и передаваемой энергии излучения. Мы предполагаем, что эти локальные изменения представляют собой  микроскопические зоны повреждения эпидермиса, который отслаиваются в течение последующих 3 недель.

Выводы

Наблюдаемые нами внутриэпидермальные полости возникают в области так называемого лазерно-индуцированного оптического пробоя laser-induced optical breakdown (LIOB). Расположение полости соответствует локальному образованию плазмы в эпидермисе, инициированному поглощением энергии высокоэнергетического пикосекундного светового импульса меланином. Мы предполагаем, что данное лазерное воздействие приводит к удалению пигментированных участков кожи, рубцов постакне, запускает процесс образования нового коллагена, соединительной ткани и муцина. Локальные изменения тканей в области LIOB запускают механизм восстановления эпидермиса, что наилучшим образом сказывается на внешнем виде и состоянии кожных покровов. Lasers Surg. Med. 2016 Wiley Periodicals, Inc.

Ключевые слова: дифракционный оптический массив линз; лазерно-индуцированный оптический пробой, неабляционный лазер, александритовый лазер

ВСТУПЛЕНИЕ

Первым пикосекундным лазером для удаления татуировок и пигментации, который получил одобрение FDA, был александритовый лазер с длиной волны 755 нм. Было это в 2012 году. Устройство обеспечивало однородный профиль луча независимо от размеров пятна и плотности энергии.

Фракционное лечение  с дифракционной линзовой оптикой [1–3] проводилось на лазерных системах с миллисекундной длительностью импульсов для лечение шрамов от угревой сыпи, устранения клинических проявлений фотоповреждения кожи. Оптические массивы этих систем создавали области с высокой плотностью энергии, разделенные зонами с низкой плотностью энергии, для формирования фокальных областей абляционного или неабляционного повреждения кожи.

Пикосекундная лазерная система также была дополнительно оборудована наконечником с дифракционным оптическим массивом. Это устройство в 2014 году получило разрешение FDA на проведение косметологических процедур по устранению шрамов от угревой сыпи и морщин.

Недавно Брауэр и соавт. сообщили о результатах лечения атрофических рубцов на месте разрешившихся элементов угревой сыпи на лице с использованием  фракционного пикосекундного александритового лазера [4]. Они отмечают улучшение внешнего вида кожных покровов за счет сглаживания контуров атрофичных участков с одновременным повышением содержания в коже коллагена, муцина, плотности соединительнотканных волокон. Пациенты, принимавшие участие в исследовании,  сообщали об очень низком уровне боли (2,8 из 10), легкой эритеме и отеке, которые самостоятельно проходили в течение 1–4 часов после процедуры.

Гистологические исследования тканей in vivo как для обычной лазерной оптики, так и для оптического массива выявили уникальные профили повреждения кожных покровов [5,6]. В этом отчете описан прижизненный ответ тканей на лечение с использованием дифракционного оптического массива спустя 14 дней после воздействия. Профили повреждения тканей дополнительно охарактеризованы с учетом гистологических изменений и изменений, выявленных с помощью конфокального микроскопа.  Результаты этого исследования могут быть использованы как руководство по выбору параметров лазерной системы для выполнения процедур омоложения кожи, лечение пигментных нарушений, шрамов от угревой сыпи и фотоповреждения кожи.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пикосекундный александритовый лазер с длиной волны 755 нм с дифракционным оптическим массивом (PicosureTM, Cynosure, Westford, MA) был использован для обработки кожи in vivo при трех различных показателях плотности энергии и размерах пятна, выставляемых в настройках аппарата (таблица 1).

Решетка дифракционных линз состоит из плотно прилегающих друг к другу  шестигранных линз, расстояния между центрами которых составляет 500 µm. Дифракционный линзовый массив изменяет профиль интенсивности воздействия лазерного луча александритового лазера таким образом, чтобы сформировалась гексагональная решетка с зонами высокоинтенсивного воздействия, окруженными областями с низкой интенсивностью воздействия.

Приблизительно 70% всей энергии доставляется в зоны высокоинтенсивного воздействия, составляющие менее 10% обработанной площади за один проход без перекрытия. Остальные 30% энергии приходятся на области с низкой интенсивностью воздействия (рис. 1).

Мужчинам (3) и женщинам (8) с I – VI типами кожи по Фитцпатрику, в возрасте 28–64 лет с индексами меланина (ИМ) 10–35, включая одного пациент с витилиго, лазерное лечение проводилось на коже спины и ладонной поверхности предплечья. Индекс меланина пропорционален концентрации меланина в коже и изменяется в диапазоне 0–99, где 0 -самый белый и 99 самый темный. Измерение содержания пигмента в коже проводилось с применением электронного измерителя меланина (SkintelTM, Cynosure, Westford, MA). Корреляция между типом кожи по Фицпатрику и индексом меланина представлена на Рис. 2.

Размер обрабатываемых участков квадратной формы составил 2 х 2 см. В пределах этих квадратов выполнялся один проход лазером для конфокальной визуализации или три прохода для проведения биопсии, для получения информативных образцов тканей в зонах повреждения. Забор биопсии и исследование с помощью конфокального микроскопа были выполнены сразу после процедуры и через 24 часа после лечения. Полученные в ходе биопсии образцы тканей были зафиксированы в формалине,  срезы окрашивали или гематоксилин-эозином (H&E), или по методу Фонтана-Масон. Окрашенный срезы исследовали с помощью световой микроскопии следователь и врач-патологоанатом.

Микроскопический анализ проводился с использованием трех объемных изображений, полученных сразу и спустя 24 часа  после проведенного лечения с помощью Vivascope 1500, диагностического конфокального микроскопа бренда  Caliber Imaging  and Diagnostics (ранее Lucid Inc.,Андовер, Массачусетс). Базовые изображения представляют собой плитки размером 50 х 500 µm², сшитые вместе для обеспечения более широкого поля обзора, которое может составить до 8 х 8 мм² при заданной глубине. Эти сшитые изображения, изображающие состояние тканей на разной глубине с шагом 10 µm затем располагают стопкой для того, чтобы получить трехмерное изображение. Фотографии также были сделаны во время предварительных посещений.

Это исследование было одобрено Наблюдательным советом Новой Англии и все субъекты дали согласие на участие в исследовании.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Гистологическое исследование с окрашиванием образцов гематоксилин-эозином, выполненное сразу после лечения, позволило выявить наличие четких, округлых внутриэпидермальных полостей (вакуолей) размером от 35 до 65 µm (Рисунок 3). Поврежденные и мертвые кератиноцины обнаруживаются вокруг вакуолей, однако их распространение не превышает одного или двух клеточных слоев. Расположены вакуоли на глубине от зернистого слоя эпидермиса до дермально-эпидермального соединения.

Вакуоли в образцах тканей, взятых через 24 часа после лечения на более темных типах кожи, содержали клеточные фрагменты. Окрашивание образцов по методу Фонтана-Масон позволяет предположить наличие в вакуолях меланина (рис. 4).

Вакуоли, обнаруженные в образцах более светлой кожи с меланиновым индексом 12 и меньше, содержали эритроциты. В коже независимо от светотипа не было обнаружено явного повреждения окружающих и глубжележащих клеток и внеклеточных структур ни сразу после процедуры, ни спустя 24 часа после лазерного воздействия. У пациентов с более темной кожей через 24 часа после процедуры появились темные пятна, рисунок которых совпадал м шагом соответствующего оптического массива насадки лазера. Сохранялось потемнение в течение 3 недель. Появление точек наблюдалось независимо от плотности энергии излучения, хотя интенсивность окраски пятен значительно уменьшалась с уменьшением флюэнса. По мере уменьшения энергии становился меньше диаметр вакуолей, а глубина их расположения увеличивалась, что вероятно связано с увеличением концентрации меланина в более глубоких слоях эпидермиса, как это показано на Рис.5.

Лимфоцитарное периваскулярное воспаление легкой и умеренной степени было обнаружено в сосочковом слое дермы [7]. У более светлокожих людей с индексом меланина 17 образования вакуолей не наблюдалось при флюэнсе 0,25 Дж/см², но наблюдались при плотности энергии импульсов 0,71 и 0,4 Дж/см² (Рис.6).

Через 5 дней и через 2 недели после лазерного воздействия микроскопические зоны некроза, содержащие клеточный детрит, располагались на уровне или немного глубже рогового слоя эпидермиса (Рис.7). Эти зоны постепенно продвигаются по направлению к поверхности кожи и слущиваются вместе отмершим эпидермисом  через 3-5 недель после проведенной процедуры.

Петехии наблюдались у пациентов с наиболее светлой кожей (MI <12). Вероятность их появления увеличивалась в соответствии с увеличением плотности потока энергии. Четкого рисунка они не имели. В отличие от людей с более темной кожей у светлокожих (IM 10-12) вакуоли обнаруживались только после воздействия лазерных импульсов с максимальной плотностью энергии 0,71 Дж/см² и располагались на уровне дермо-эпидермального соединения. Эти вакуоли были нетипичными, несколько неправильной формы, с менее четкими границами, и располагались в непосредственной близости с зонами дермальной экстравазации эритроцитов из поверхностных капиллярных петель. Через 24 часа после обработки эти вакуоли были заполнены эритроцитами (Рис. 8).

Исследование с применением конфокального микроскопа, проведенное сразу после лазеротерапии, не выявило патологических изменений в эпидермисе и сосочковом слое дермы независимо от типа кожи пациентов и параметров лазерного излучения.  В светлокожих пациентов с ИМ <12 и у пациента с витилиго не было выявлено признаков повреждения в течение всего срока восстановления после процедуры. Спустя 24 часа после лазерного воздействия четко очерченные сферические вакуоли, которые на полученных изображениях биоптатов имеют вид светлых округлых участков,  были выявлены только у лиц с ИМ> 15 (Рис. 9).

По мере повышения индекса меланина и флюэнса  наблюдается увеличение размеров и плотности (количества на единицу площади)вакуолей. Диаметр вакуолей составил от 25 до 70 µm, средняя глубина расположения составила от 55 до 75 µm на уровне шиповатого слоя эпидермиса. Рисунок 10 демонстрирует зависимость между диаметром вакуолей и плотностью потока энергии у двух темнокожих (MI = 31, 32) пациентов.

Совмещение конфокальных изображений, полученных при исследовании кожи лиц с высоким содержанием меланина, позволяет получить шестиугольный узор с шагом, который примерно соответствует шагу дифракционной оптической решетки, используемой для лечения (Рис. 11).

Пикосекундный александритовый лазер с длиной волны 755 нм с  дифракционным оптическим массивом создает большое количество очаговых зон внутриэпидермального повреждения в шиповатом слое эпидермиса. В местах воздействия лазерной энергии образуются вакуоли. Исследование тканей с помощью конфокальной микроскопии и гистологического исследования с окрашиванием срезов гематоксилином-эозином позволило установить, что роговой слой и все ткани, окружающие вакуоли, остаются абсолютно нормальными и не имеют признаков сопутствующего термического повреждения.

Характер тканевых повреждений резко контрастирует с эпидермальными и дермальными повреждениями, которые наблюдаются при неаблятивном и аблятивном фракционном лечении. В недавнем клиническом исследовании с использованием фракционного пикосекундного александритового лазера образование вакуолей в эпидермисе было связано со стимуляцией синтеза нового коллагена, муцина, формированием соединительной ткани [4].

Кератиноциты в ответ на повреждение начинают синтезировать и выделять повышенное количество факторов роста, хемокинов, цитокинов [8]. Стимуляция и регуляция реакции на повреждение или травму посредством химических веществ осуществляются посредством рецепторов на поверхности дермальных и эпидермальных клеток. Было высказано предположение, что быстрое образование вакуолей в местах формирования лазерно-индуцированного оптического пробоя может создавать колебания давления в коже [9]. Это  воздействие на ткани может вызывать изменение передачи сигналов в клетках, приводить к активному высвобождению цитокинов, изменению клеточных мембран, инициировать ремоделирование дермы [6,10].

Образование вакуолей происходило в зонах высокой плотности энергии. Вероятность формирования вакуолей определялась степенью фокусировки энергии лазерного излучения в узлах дифракционной линзовой решетки и количеством пигмента в коже. Для более темных типов кожи с высоким содержанием меланина изменения, выявляемые с помощью конфокального микроскопа, представляли собой достаточно светлую область округлой формы, которая предположительно выглядела так в результате рассеивания света клеточным детритом, состоящим из ядер и меланосом, расположенных внутри вакуоли.

По мере того, как снижалось содержание пигмента в коже, уменьшался размер, количество и плотность расположения вакуолей в тканях. В светлой коже характер повреждений имеет свои особенности. В ходе гистологического исследования образование вакуолей, сопровождающееся кровоизлиянием, было обнаружено на уровне дермо-эпидермального перехода.

Повреждение сосудов наблюдалось только при более высокой плотности энергии 0,71 Дж/см². Степень поражения сосудов во многом определяется индексом меланина. Чем выше ИМ, тем ниже вероятность кровоизлияния в ткани. При низком количестве меланина в коже целевым хромофором, по видимому, становится гемоглобин эритроцитов, находящихся в сосудах поверхностной капиллярной сети.

Полученные результаты иллюстрируют важную роль меланина в ограничении маштабов повреждения кожи и локальном формировании вакуолей в эпидермисе, позволяют устанавливать безопасный порог плотности энергии лазерного излучения в зависимости от концентрации пигмента в коже пациента.  Связь вакуолей и развития клинических эффектов лазеротерапии является предметом дальнейших исследований, но физический процесс, приводящий к их образованию, известен, так что при выполнении ряда последовательных шагов можно получить ожидаемый результат.

Формирование вакуолей в сетчатке при лазерном нагревании теоретически проанализировано в литературе [11]. В теории полость образуется в результате расширения пара при поглощении энергии лазерного импульса меланином сетчатки, нагреве и испарении воды. Короткий лазерный импульс, длительность которого составляет менее микро-секунды, быстро отдает энергию хроматофору. Это приводит к практически мгновенному нагреву с последующим формированием полости. Расширение пузыря с паром продолжается спустя долгое время после того, как импульс закончился.

В нашем случае целевым хромофором является меланин эпидермиса. Однако одного только поглощения энергии лазерного излучения  гранулами пигмента недостаточно для объяснения механизма образования пузырей. Для этого необходим хроматофор, который в 100 раз лучше поглощает энергию световых импульсов. Получить такой эффект, как мы наблюдаем при проведении гистологического исследования, позволяет физический процесс, известный как лазерно-индуцированный оптический пробой (LIOB).

В процессе термоэмиссии при LIOB нагретый лазером меланин испускает один или несколько электронов, которые становятся “затравочными” (Рис. 12А). Свободные электроны очень эффективно поглощают энергию лазерного излучения и начинают сталкиваться с окружающими молекулами. Когда энергия затравочного электрона превышает уровень, необходимый  для ионизации молекулы меланина, при следующем столкновении “выбивается” второй свободный электрон. Этот процесс многократно повторяется, плотность и энергия свободных электронов растут, образуется ионизированная плазма. Эта плазма продолжает активно поглощать остаточное лазерное излучение (Рис. 12В).

Образовавшаяся горячая плазма нагревает окружающие ткани за счет электрон-молекулярных столкновений даже после того, как лазерный импульс закончится (Рис. 12C). Теоретический анализ показывает, что энергии плазмы достаточно для расширения парового пузыря и формирования внутриэпидермальной вакуоли (Рис. 12D) [12].

Процесс формирования формации лазерно-индуцированного оптического пробоя определяется интенсивностью формирования начальных “затравочных” электронов, эффективности поглощения энергии лазерного излучения. Генерация “затравочных” электронов при термоэлектронной эмиссии носит статистический характер.

Теоретические выкладки, касающиеся связи вероятности термоэлектронной эмиссии с параметрами лазерного излучения и концентрацией меланина в коже будут представлены нами в другом месте. На практике, чем больше плотность энергии лазера или концентрация меланина, тем раньше лазерный импульс инициирует появление “затравочных” электронов и образование LIOB, тем больше энергии остаточного лазерного импульса поглощает плазма, и тем больше по размеру получаются вакуоли.

У светлокожих людей вероятность образования LIOB наиболее высока в более глубоких областях эпидермиса, тем глубже, чем ниже содержание пигмента [7]. Выявление геморрагических вакуолей в эпидермисе или поверхностном сосочковом слое дермы позволяет предположить, что процесс LIOB может повредить кровеносные сосуды поверхностной капиллярной сети кожи и инициировать выход эритроцитов и гемоглобина в ткани [13].

Ограничением этого исследования стало то, что количество испытуемых было недостаточным для получения статистической значимых результатов анализа размеров и глубины расположения вакуолей в зависимости от плотности потока энергии и концентрация меланина. Изложенные в публикации результаты позволяют отследить некоторые тенденции, которые подтверждаются теоретическими выкладками, представленными в других источниках.

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование позволило нам описать новый тип повреждений эпидермиса, вызванного воздействием пикосекундного александритового лазера с дифракционным оптическим массивом. Меланин является основной мишенью лазерного воздействия. Активное поглощение энергии в тканях приводит к формированию лазерно-индуцированного оптического пробоя с последующим формированием вакуолей в эпидермисе. Это ограниченное повреждение тканей провоцирует активизацию процесса репарации тканей, синтеза коллагена, муцина, образования соединительной ткани с минимальным временем восстановления после проведенной процедуры лазеротерапии.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Manstein A, Herron GS, Sink RK, Tanner H, Anderson RR. Fractional photothermolysis: A new concept for cutaneous remodeling using microscopic patterns of thermal injury. Lasers Surg Med 2004;34(5):426–438.

2. Lloyd J, Tanghetti E. Comparison of affirm 1320/1440 nm vs 1320 nm for the treatment of acne scars—A clinical and histological study. Lasers Surg Med 2008;40(S20):66.

3. Tanghetti E, Weiss R. Multicenter study of microthermal laser treatment of acne scars. Lasers Surg Med 2007;39(S19): 112.

4. Brauer JA, Kazlouskaya V, Alabdulrazzaq H, Bae YS, Bernstein LJ, Anolik R, Heller PA, Geronemus RG. Use of a picosecond pulse duration laser with specialized optic for treatment of facial acne scarring. JAMA Dermatol 2015;151(3):278.

5. Tanghetti E, Tanghetti M. A clinical and histologic study of skin treated with a pico-second alexandrite laser comparing a uniform treatment spot and a spatially modulated spot. Lasers Surg Med 2014;46(S25):86.

6. Tanghetti E. Characterization of the histologic changes in the Skin from the treatment with the 755 nm Picosecond Alexandrite Laser. Lasers Surg Med 2015;47(S26):24.

7. Nielsen KP, Zhao L, Ryzhikov GA, Biryulina MA, Sommersten ER, Stamnes JJ, Stamnes K, Moan J. Retrieval of the physiological state of the human skin from UV-Vis reflectance spectra—A feasibility study. J Photochem Photobiol B 2008;93:23–31.

8. Werner S, Krieg T, Smola H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol 2007; 127(5):998–1008.

9. Vogel A, Busch A, Parlitz U. Shock wave emission and cavitation bubble generation by picosecond and nanosecond optical breakdown in water. J Acoust Soc Am 1996;100(1):148.

10. McDaniel D. Gene expression analysis in cultured human skin fibroblasts following exposure to a picosecond pulsed alexandrite laser and specially designed focus optic. Lasers Surg Med 2015;47(S26):22.

11. Gerstman BS, Thompson CR, Jacques SL, Rogers ME. Laser induced bubble formation in the retina. Lasers Surg Med 1996;18(1):10–21.

12. Mirkov M, Sierra R, Tanghetti E. Theoretical analysis of the mechanism producing the histologically observed epidermal changes with a picosecond alexandrite laser with Diffractive Lens Array. Lasers Surg Med 2016;48(S27):1.

13. Habbema L, Verhagen R, Van Hal R, Liu Y, Varghese B. Minimally invasive non-thermal laser technology using laser-induced optical breakdown for skin rejuvenation. J Biophotonics 2012;5(2):194–199.